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ヒトiPS細胞から血小板を安定的に大量に供給する方法を開発

中村壮研究員(京都大学CiRA)、江藤浩之教授(京都大学CiRA)らの研究グループは、ヒトiPS細胞から自己複製が可能な巨核球を誘導することに成功し、大量に血小板を生産する方法を確立しました。これまでにもiPS細胞から血小板をつくることはできていましたが、輸血に必要なスケールで血小板を生産するのは困難でした。今回は血小板を生み出す細胞である巨核球に着目し、これまでよりも大きなスケールで、医療現場で使用できる量の血小板を生産することを可能としました。

この研究成果は2014年2月13日正午(米国東部時間)に米国科学誌「Cell Stem Cell」で公開されました。

ポイント

・従来の方法では、iPS細胞から輸血に必要な血小板注1量の100分の1程度しか作れなかった。

・生体外で自己複製し凍結保存が可能な不死化巨核球注2を誘導する方法を確立した。

・巨核球をストックすることで血小板製剤の供給を安定化できる。


1.研究の背景

 血小板は止血に重要な役割を果たす血液細胞で、巨核球という細胞から分離することで生み出され、血液の中を循環しながら、止血で利用されるか一定の寿命で崩壊します。自ら分裂することはできないので、常に巨核球から作られ、必要量が補充されています。現在、深刻な貧血および出血素因をもたらすような血液疾患の患者さんは、献血による血液製剤を用いた輸血に頼らざるを得ない状況です。しかし、献血ドナーの数は少子高齢化等もあり、減少しています。厚生労働省の統計によると、2027年には我が国の必要な輸血製剤の20%はドナー不足に伴い供給できないと発表されています。

 特に血小板は機能を維持するために室温で保存する必要があり、採血後4日間しか有効期間がありません。そのため、必要なときに必要な量の血小板を供給することが困難です。こうした状況を改善するためには、ドナーに依存しないで血小板などの血液製剤を生産する仕組みが必要です。

 江藤教授らのグループは2010年に皮膚細胞由来のiPS細胞から培養皿上で血小板が生産できることを発表しました。しかし1回の輸血では患者さん1人につき2000~3000億個もの血小板が必要ですが、これまでの方法では、10億個程度しか生産できませんでした。そこで今回は血小板前駆細胞である巨核球に着目し、長期間にわたって自己複製することができる巨核球の誘導を試みました。

2.研究結果    

1) ほぼ無限に複製できる巨核球の作製

 これまでの研究で、c-MYCを働かせることで、血小板の生産量を増やすことができることが分かっていました。本研究ではさらに造血幹細胞の細胞分裂に重要な働きをするBMI1やアポトーシスを抑制するBCL-XLという遺伝子を利用することで、5ヶ月以上自己複製可能な巨核球をiPS細胞から誘導することが出来ました。具体的には、iPS/ES細胞から2週間かけて誘導した造血前駆細胞注3に2種類の遺伝子(c-MYCとBMI1)を導入し、さらに2~3週間後に1つの遺伝子(BCL-XL)を追加で働かせることで、ほぼ無限に複製できる巨核球を作製することに成功しました(Fig. 1)。
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2) 自己複製できる巨核球を成熟させて血小板を生産

 巨核球で強制的に働かせていた3つの遺伝子の働きを止めると、およそ5日後には巨核球が成熟し、血小板を生産しました(Fig.2)。この方法では直径10 cmの培養皿(10 mLの培養液)で巨核球を培養し、200~400万個の血小板ができました。つまり、25~50 Lの培養液を用いれば輸血に必要な1000億個の血小板を5日以内に用意できることになります。
PR_Fig2-thumb-480x220-1162.jpg

3) 生産した血小板の機能評価

 今回の方法で生産した血小板はトロンビン注5の存在下で凝集するなど(Fig. 3)、基本的な血小板の機能を持っていました。ヒトから採血した直後の血小板と比べると反応が弱かったものの、保存した血小板やiPS細胞から直接誘導する方法で作成した血小板と比較すると強い反応を示しました。従って、今回の方法で生産した血小板は十分に機能すると考えられます。
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3.まとめ     

 従来のiPS細胞から血小板を生産する方法では、輸血に必要な1000億個もの血小板を生産するためにはヒトiPS細胞が70億個程度必要で、最終的に血小板を得るまでに26日程度必要でした。しかし今回の方法では、250億個の自己複製する巨核球前駆細胞を使用して5日で血小板を得ることができます。培養する装置も、実験室レベルのシャーレ(10mL)からバッグ(1~500L)にすることで複雑な設備を使わずに大量に培養することが出来ます。このシステムにより、日本人に多いHLA型のiPS細胞から血小板製剤を生産するための巨核球のストックや、ドナーが見つかりにくいHLA型やその他の特殊な血小板型(HPA型)の患者さんへの血小板製剤の安定供給が可能となります。今回、研究グループは将来の臨床研究、臨床試験を考慮した巨核球細胞の製造方法を決定したことになります。また、本研究では複数の巨核球を不死化する方法を比較し、より安全な製造方法を見つけました。

 このシステムを用いた臨床研究を平成27~28年に計画しており、最終的には臨床試験を経て10年後の実用化を目指しています。

4.論文名と著者

・論文名

"Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically-applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells"

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プロフィール

古谷 雅人

Author:古谷 雅人
平成23年1月頃から首が重く感じ、気をつけていないと前に下がるようになった。その後、背中をまるめるようになり、これを防ぐために意識的に体をそらして姿勢を保つようになった。
4月になっても上記症状は変わらず、体の反りと同時に首が下がるため顎を手で支えないと行動ができなくなった。また肩があがらず洗濯物やタオル等が取れなくなった。体重も数か月で5キロ減り、呼吸も浅く息苦しい為、身体に異常を感じ医師の診断を受けることにした。

病院でレントゲンをとったが、骨に異常はないと言われた。肩や腰に痛みがあったため、内服薬を処方してもらい、様子をみることとなった。

骨に異常がないと言われたが、首が下がる、肩が上らない、体が反る、体幹の異常が続いたためクリニックを受診した。初診時の血液検査では異常はみられず、再診時に詳しい血液検査を行うとCK値が高いことが判明。医師から専門の医療機関にかかるように指示され、紹介状を書いてもらった。椅子に長時間座るとお尻が痛くなるため長時間同じ姿勢で座ることが不可能になった。

クリニックの紹介で受診し、医師から精査が必要と言われ、8月から9月にかけ入院し筋生検、筋電図、MRI、嚥下障害の検査を行った。10月の外来でM蛋白が見つかり骨髄生検を行い形質細胞の増殖が確認された。11月に再入院し検査を行い、12月初旬にステロイドパルス療法を行い3度目の入院をした。この一連の検査・治療により、「単クローン性ガンマグロブリン血症に伴う成人発症型ネマリンミオパチー」と確定診断された。
平成24年1月に4度目の入院をし、形質細胞に対する化学療法治療を受けた。その後は、経過観察を目的に月1回のペースで通院していたが、平成25年7月に、筋力がさらに低下したため、医師から1か月間、ステロイド剤を内服するよう指示された。

血漿交換の甲斐があり、フリーライトチェーンの結果は正常に戻りつつある。
あとはリハビリを頑張るのみ。この病気と上手に向き合い少しでも病気の理解とより多くの人に認知されることを祈る。

先天性ミオパチー紹介資料(10月改訂版3)
http://yahoo.jp/box/_9Z9r2

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